УДК 577.151

Цикуниб А.Д., Шестопалова Д.И., Толочинская Е.Ю.

ФГБОУ ВО «Адыгейский государственный университет»

Разработка полуколичественного тест-метода ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗЫ ПО УРОВНЮ потемнения мякоти яблок

Аннотация. В статье описан механизм ферментативного потемнения мякоти яблок и его влияние на технологию получения продуктов переработки фруктов. Обоснована приемлемость разработанного полуколичественного тест-метода для определения активности полифенолоксидазы по уровню потемнения мякоти яблок.

Ключевые слова: яблоко, ферментативное потемнение, полифенолоксидаза, полуколичественный тест-метод.

Tsikunib A.D., Shestopalova D.I., Tolochinskaya E.Yu.

Adyghe State University, Maykop, Russia

DEVELOPMENT OF A SEMI-QUANTITATIVE TEST-METHOD FOR DETERMINATION OF POLYPHENOLOXIDASE ACTIVITY BY THE LEVEL OF DARKNESS OF APPLE PULP

Abstract. The article describes the mechanism of enzymatic browning of apple pulp and its influence on the technology for obtaining fruit processing products. The acceptability of the developed semi-quantitative test method for determining the activity of polyphenol oxidase by the level of browning of the pulp of apples is substantiated.

Keywords: apple, enzymatic browning, polyphenol oxidase, semi-quantitative test method.

Актуальность. Яблоко - один из самых распространённых и популярных фруктов не только в России, но и во всём мире. Яблоко содержит много веществ антиоксидантной группы, известных как полифенолы, которые преимущественно локализуются в хлоропластах [1]. Полифенолоксидаза (ПФО), представляющая собой смесь ферментов, таких как монофенолоксидазы и катехолоксидазы, присутствует почти во всех тканях растений. Фенольные соединения быстро окисляются в присутствии кислорода под действием фермента полифенолоксидазы до о-хинонов, затем отдельные молекулы о-хинона полимеризуются, образуя соединение меланин, в результате чего мякоть яблока приобретает бурый цвет [2]. Уровень полифенолоксидазной активности и концентрация фенольных соединений могут варьироваться в зависимости от сорта плодов и степени их зрелости. Ферментативное потемнение – одно из наиболее важных реакций, происходящих во фруктах и овощах, обычно приводящее к негативному влиянию на цвет, вкус, аромат и пищевую ценность продукта. Потемнение мякоти и сока плодов яблок – это биохимический процесс, отрицательно влияющий на технологию получения продуктов переработки яблок, таких как джемы, соки, пюре, повидло, желе [3]. Существует ряд методов определения активности полифенолоксидазы, в частности, титриметрические и спектрофотометрические, иммуноферментный анализ и высокоэффективная жидкостная хроматография. Эти методы определения ферментативной активности в пищевых продуктах надёжны, но требуют больших временных затрат [4], дорогостоящего оборудования и реактивов [5], поэтому разработка полуколичественного тест-метода, позволяющего анализировать партии поступившего сырья на эффект потемнения в условиях производства без применения дорогостоящих реактивов и оборудования, является актуальной [6, 7].

Гипотеза исследования: эффект потемнения мякоти плодов яблок может быть положен в основу полуколичественного тест-метода определения активности ПФО.

Целью исследования явилась разработка полуколичественного тест-метода определения активности полифенолоксидазы по уровню потемнения мякоти яблок.

Дизайн исследования. Исследована интенсивность потемнения мякоти 5 сортов яблок: Симиренко, Гренни Смит, Флорина, Айдоред и Бребурн. Плоды собирали с яблонь, выращенных в Республике Адыгея промышленным способом.  Сбор плодов был произведен во время коммерческого урожая (конечной стадии развития плодов). В качестве прототипа полуколичественного тест-метода использовали метод, описанный в статье Daniel Ferreira Holderbaum, Tomoyuki Kon, Tsuyoshi Kudo, and Miguel Pedro Guerra: «Enzymatic Browning, Polyphenol Oxidase Activity, and Polyphenols in Four Apple Cultivars: Dynamics during Fruit Development» [8].

Оборудование: ручная терка (диаметр отверстий 0,5 см), белая разделочная доска, весы марки Ohaus, керамический нож.

Подготовка проб: с каждого яблока вырезали три продольных ломтика и очищали от кожуры, а сердцевину выбрасывали, затем ломтики яблок натирали ручной теркой (диаметр отверстий 0,5 см), выкладывали в форме прямоугольника на белую разделочную доску и делали фотографии для каждого образца фруктов сразу после натирания и через 12 часов. Фотографии загружали в онлайн калькулятор – код цвета RGB, фиксировали значения R и B для времени 0 и 12 часов. Затем находили исходное ΔС (разницу между R и B). Итоговое ΔС является разницей между исходными ΔС (12 часов) и ΔС (0 часов).   

Принцип предлагаемого метода. Определение интенсивности потемнения мякоти за определенный промежуток времени (12 часов). Оценка результатов проводится с применением параметров системы RGB. Этот алгоритм оттенков выстраивается на 3-х основных цветах: R (red) – красный; G (green) – зеленый; B (blue) – голубой. Для измерения цветового различия использовали значения R и B. Для подсчёта значений параметров RGB использовали онлайн калькулятор – код цвета RGB, представленный в открытом доступе.

Таблица 1- Динамика значений ΔС от R до B мякоти исследованных сортов яблок за определенный промежуток времени (0-12 часов).

Сорт	Время	ΔС от R до B		Интервал цветового потемнения (12ч)
		исходное	итоговое
Флорина	(0) (12)	240-76=164 219-7=212	48
Гренни Смит	(0)                      (12)	200-8=192 238-7=231	39
Симиренко	(0)              (12)	112-9=103 166-4=162	59
Бребурн	(0) (12)	230-90=140 161-7=154	14
Айдоред	(0)                 (12)	193-38=155 202-8=194	39

Как видно из полученных результатов, самое высокое значение итогового ΔС продемонстрировала мякоть сорта Симиренко, что свидетельствует о более высоком уровне ферментативного потемнения, а значит более высоком уровне активности ПФО в течение 24 часа. За Симиренко следует сорт Флорина, интенсивность потемнения мякоти которого в 1,23 раза ниже. В сравнении с сортом Симиренко итоговое ΔС мякоти сортов Гренни Смит и Айдоред ниже в 1,51 каждый. Мякоть яблока сорта «Бребурн» показало наименьшее значение итогового ΔС по сравнению с другими сортами, в частности в 4,21 раза меньше, чем Симиренко, что свидетельствует о более низком уровне ферментативного потемнения мякоти и низкой активности ПФО за 24 часовой период.

Выводы. Предлагаемый нами полуколичественный тест-метод позволяет ранжировать разные сорта яблок по степени устойчивости к ферментативному потемнению мякоти под действием ПФО. Метод может быть реализован в заводских условиях и в условиях фермерских хозяйств; метод прост в исполнении, не требует специального оборудования и реактивов.

Литература.

1. Lynne McLandsborough. Why do apple slices turn brown after being cut? [электронный ресурс] (2007)  URL:https://www.scientificamerican.com/article/experts-why-cut-apples-turn-brown/ (Дата обращения: 16.03.2023).
2. Rebecca Fox. Why do apples turn brown after you cut them? [электронный ресурс] (2019) URL: https://letstalkscience.ca/educational-resources/stem-in-context/why-do-apples-turn-brown-after-you-cut-them (Дата обращения: 16.03.2023).
3. Whitaker, JR & Lee, CY  Последние достижения в области химии ферментативного подрумянивания [электронный ресурс] (1995) Lee C.Y. &4.
4. Erica Siguemoto, Jorge Gut. Validation of spectrophotometric microplate methods for polyphenol oxidase and peroxidase activities analysis in fruits and vegetables. [электронный ресурс]  (2017) URL:https://www.researchgate.net/publication/317602713_Validation_of_spectrophotometric_microplate_methods_for_polyphenol_oxidase_and_peroxidase_activities_analysis_in_fruits_and_vegetables (Дата обращения: 16.03.2023)
5. Аdvantages and disadvantages of Chromatography [электронный ресурс] URL:https://www.google.com/amp/s/whatishplc.com/hplc-basics/advantages-and-disadvantages-of-chromatography/amp/(Дата обращения: 16.03.2023)
6. Йорук Р., Маршалл М.Р. Физико-химические свойства и функции растительной полифенолоксидазы: обзор. Дж. Пищевая биохимия. 2003 г.; с.27 :361–422.
7. Майер А.М. Полифенолоксидазы в растениях и грибах: развитие. Обзор. Фитохимия. 2006 г.; с.67 : 2318–2331.
8. Daniel Ferreira Holderbaum, Tomoyuki Kon, Tsuyoshi Kudo, and Miguel Pedro Guerra «Enzymatic Browning, Polyphenol Oxidase Activity, and Polyphenols in Four Apple Cultivars: Dynamics during Fruit Development». [электронный ресурс]  URL: https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/45/8/article-p1150.xml (Дата обращения: 16.03.2023)

______________________________________________________________________________________________________________

Цикуниб Аминет Джахфаровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой химии, заведующая лабораторией нутрициологии, биотехнологии и экологии НИИ КП АГУ, 385000, г. Майкоп, ул. Гагарина, 13, тел. 8928461725, email: cikunib58@mail.ru ;

Tsikunib Aminet Dzhakhfarovna, doctor of biological sciences, professor, Head of the Department of Chemistry, Head of Nutrition, biotechnology and ecology Research Institute of Complex Problems Adyghe State University;

Шестопалова Диана Игоревна, студентка 1 курса факультета естествознания АГУ, email: dsalyceva@gmail.com ;

Shestopalova Diana Igorevna, 1st year student of the Faculty of Natural Science Adyghe State University;;

Толочинская Елена Юрьевна, студентка 1 курса факультета естествознания, email: elena.tolociii@icloud.com ;

Tolochinskaya Elena Yurievna, 1st year student of the Faculty of Natural Science Adyghe State University.